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附录D
(规范性附录)
抗原特异性IgE测定—酶联免疫吸附试验(ELIST)
D.1 原理
将变应原结合到固相载体—凹孔聚苯乙烯板上，加入待检血清，使之发生抗原抗体的特异结合，再加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体(马抗人IgE)，便成抗原一抗体一抗抗体的复合物，经底物显色后，通过酶标免疫检测仪测定其OD值，可知血清中特异性抗体的含量。
D.2 器材
凹孔聚苯乙烯板、微量加液器、酶标免疫检测仪、PH试纸、恒温箱、冰箱、洗瓶、湿盒、常用玻璃仪器等。
D.3 试剂
a)人血清白蛋白(HSA)(0.05％)；
b)变应原；
c)0.02mol／L(PH7.4)磷酸盐缓冲液(PBS)；
d)吐温—20(Tween—20)(每100mlPBS液中加0.05ml，制成PBS—T)；
e)牛血清白蛋白(BSA)或小牛血清(10％)；
f)0.05mol／L(PH9.6)碳酸盐缓冲液；
g)PH5.0磷酸盐一柠檬酸缓冲液；
h)邻苯二胺(OPD)；
i)30％过氧化氢；
j)辣根过氧化物酶标记的马抗人IgE；
k)2mol／L硫酸。
D.4 方法
D.4.1 包被HSA，37℃，2L。
D.4.2 PBS-T洗3次。
D.4.3 加变应原4℃过夜。
D.4.4 PBS-T洗3次。
D.4.5 加入待检血清(稀释液为PBS-T，含1％BSA，1：5稀释)37℃，90min。
D.4.6 PBS-T洗6次。
D.4.7 加入酶标抗体，37℃，90min。
D.4.8 PBS0-T洗8次。
D.4.9 加入底物液0.02％OPD，含luL／10ml过氧化氢，37℃，30min。
D.4.10 2mol／L硫酸终止反应。
D.4.11 用酶联免疫监测仪测定OD值，波长为492nm。
D.4.12 结果判定：大于正常均值2SD为阳性。 共6页 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页 |
