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附录C
(规范性附录)
抗原特异性IgE测定—放射变应原吸附试验(RAST)
C.1 原理
将变应原交联到固相聚合体，如葡萄糖凝胶、纤维素粒子或纸片上，然后加入被检血清。血清中的特异性抗体(1gE等)与变应原结合，洗去多余的血清，加入125I标记的抗IgE结合物，经过一定时间培育后，最后形成固相载体一变应原一特异性IgE一抗IgE、125I复合物。洗去多余的标记抗体。用Y射线计数仪测定留在纸片上的放射素含量，便可知血清中特异性IgE的含量。
C.2 器材
新华滤纸或瓦特曼I号滤纸、微量加液器、布氏滤纸、y射线计数器、负压吸引器、磁力搅拌器、pH计或试纸。
C.3 试剂
a）变应原；
b）溴化氰；
c）0.01mol／L(pH7.4)磷酸缓冲液；
d）5mol／L磷酸钾溶液；
e）0.005moL、0.1/L碳酸氢钠溶液；
f）马抗人IgE—IgG；
g）丙酮；
h）1mol／L、0.05mol／L乙醇胺；
i）0.1moI／L(pH4.0)乙酸—乙酸钠缓冲液；
j）牛血清白蛋白，或人血清白蛋白(HSA)。
C.4 方法
C.4.1 制备溴化氰活化滤纸片
华特曼I号或新华滤纸，用打孔器打成直径为6mm纸片(100片约300mg)。
称取4g溴化氰加80ml双蒸水，水浴溶解，搅拌。称4g纸片放火带塞三角瓶中，并用冷双蒸水浸泡 30min。吸净蒸馏水并加入5％溴化氰液80ml。用5mol／L预冷的磷酸盐调整pH在11左右，搅拌 8min，不断调整pH值。然后用0.005mol／L的碳酸氢钠800ml，分5次连续洗，再用400ml双蒸水连续洗3～4次。最后用400ml丙酮连续洗4次，放人大平皿中抽干。
C.4.2 制备抗原(根据抗原种类而异)
C.4.3 偶联蛋白：称取30mgHSA用0.1mol／L碳酸氢钠60mi溶解。每200片纸片放人HSA液15ml，在8C条件下转鼓转动48h。用0.1mol／L碳酸氢钠洗3次，0.01mol／L(pH7.4)的PBS洗3次。
C.4.4 偶联抗原：配制适当浓度的抗原，加入纸片后，转鼓8℃48h，之后用0.01mol／L(PH7.4)的PBS液洗3次。
C.4.5 封闭：将以上纸片加入0.25mol／L乙醇胺15ml，SC，转鼓8h，0.1mol／L碳酸氢钠洗3次， 0.1mol／L(pH4.0)乙酸一乙酸钠洗3次，0.01mol／L(pH7.4)PBS洗3次。4℃保存备用。
C.4.6 RAST试验步骤
C.4.6.1 将偶联过抗原及蛋白的纸片放人试管底部，每管1张。
C.4.6.2 将待检血清按一定稀释浓度(一般为1：5)每管加入50uL于滤纸圆盘上，另取缓冲液和阴性血清各50uL，分别加入滤纸圆盘上作为对照，加盖，室温孵育3h。
C.4.6.3 用负压吸引器除去各管液体后，再用含0.3％马血清的0.05mol／L(PH7.4)PBS洗3次。
C.4.6.4 在每管滤纸圆盘上加入125I标记的马抗人IgE抗体50uL(约5～80000CMP)。室温过夜，之后按上法洗3次。
C.4.6.5 吸干后用Y计数仪测放射强度(CPM／min)，与正常人对照，分数大于正常均值的两个标准差 (2SD)为阳性。
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